撰文 | 鹹姐
線粒體是細胞內的能量工廠，其功能的正常執行對於細胞的生存和代謝至關重要。線粒體的生物合成依賴於大量核基因編碼的蛋白質透過線粒體外膜複合體 （TOM） 和內膜複合體 （TIM） 輸入線粒體基質。這一過程高度複雜且高度調控，涉及多個步驟：首先，蛋白質前體在細胞質中合成後，透過TOM複合體進入線粒體基質，隨後在TIM複合體的協助下被進一步轉運至線粒體基質或嵌入線粒體內膜 （IMM） 。然而，當蛋白質輸入受阻時，會導致線粒體功能障礙，甚至細胞死亡。這種輸入受阻可能由多種因素引起，例如蛋白質摺疊錯誤、輸入通道堵塞或線粒體膜電位的喪失。近年來，研究者們對線粒體蛋白質輸入受阻後的細胞響應機制進行了深入研究，揭示了多種質量控制途徑，例如酵母中的MitoCPR （線粒體受損蛋白質輸入響應） 和MitoTAD （線粒體蛋白質轉運相關降解） 通路【1,2】。然而，在哺乳動物細胞中，這些機制的具體作用尚不清楚。此外，線粒體蛋白質輸入受阻還可能引發細胞內的應激反應，如啟用未摺疊蛋白反應 （UPR） 或整合應激反應 （ISR） ，這些反應透過調節基因表達來維持細胞內環境的穩定。儘管如此，哺乳動物細胞中是否存在類似的機制，以及這些機制如何協同作用以應對線粒體蛋白質輸入受阻，仍然是當前研究的熱點問題。
近日，來自美國國立衛生研究院的Richard J. Youle團隊和東京醫科齒科大學Koji Yamano團隊合作在Nature Cell Biology上線上發表了文章Mitochondrial YME1L1 governs unoccupied protein translocase channels，開發了一種哺乳動物細胞中的線粒體蛋白質輸入阻斷系統，模擬線粒體蛋白質輸入受阻的情況，揭示了線粒體蛋白質輸入受阻後細胞的響應機制，特別是YME1L1（一種ATP依賴性蛋白酶）在維持線粒體質量和細胞健康中的關鍵作用，其可透過降解停滯在外膜複合體中的前體蛋白，以及清除未被佔據的TIM23 （線粒體內膜上的一個蛋白質轉運複合體） 通道中的組分 （如TIMM17A和TIMM23） ，來維持線粒體的正常功能。
本文研究人員構建了一個用於堵塞線粒體蛋白輸入通道的前體蛋白——IDF （IMMT-DHFR-FLAG） 。IDF由線粒體內膜蛋白MIC60 （包含線粒體靶向序列、跨IMM的跨膜結構域及後面的82個氨基酸） 的N端與二氫葉酸還原酶 （DHFR） 融合而成。透過在HeLa細胞中誘導表達IDF，並利用甲氨蝶呤 （MTX） 穩定DHFR結構域，研究人員成功地將IDF固定線上粒體外膜 （OMM） 的TOM複合體中，從而模擬了線粒體蛋白輸入受阻的情況（圖1）。實驗結果表明，IDF-MTX複合體能夠特異性地阻斷TOM複合體，且不影響線粒體膜電位，而且其能夠有效阻斷線粒體對其他前體蛋白的輸入，從而導致細胞生長速率顯著下降。
圖1 IDF結構（上）和IDF阻塞輸入通道（下）示意圖
mitoTAD通路可透過清除TOM複合體中堵塞的蛋白質前體來確保線粒體蛋白質輸入的正常進行。已有研究表明，在酵母中，Cdc48及其輔助因子Ubx2能夠結合TOM複合體，提取並降解堵塞的前體蛋白，防止細胞毒性。類似地，在哺乳動物細胞中，Cdc48的同源蛋白VCP （valosin-containing protein，即p97） 在PINK1-Parkin通路中發揮作用，清除OMM上泛素化的蛋白質。因此，本文研究人員首先評估了VCP在清除堵塞的IDF–MTX複合體中的作用。然而，研究結果顯示，與酵母中的Cdc48不同，儘管VCP能夠消除細胞質中的DHFR結構域，但它似乎並不能幫助降解線粒體中成熟形式的IDF或緩解哺乳動物細胞中輸入通道的堵塞。同樣的，已知MitoCPR是一種細胞應對線粒體蛋白質輸入受阻的保護機制，透過啟用特定的轉錄因子來增強線粒體的蛋白質降解能力，酵母中的Msp1 （一種定位於OMM的AAA ATPase） 是從TOM複合體中清除過量的線粒體前體蛋白所必需的。ATAD1 （ATPase family AAA domain containing 1） 是人類中Msp1的同源物，具有清除未輸入線粒體前體或錯誤定位蛋白質的相似特性。然而，本文研究人員透過實驗發現，在哺乳動物細胞中，ATAD1也不參與清除堵塞的IDF–MTX複合體。與此同時，研究人員還發現，雖然在使用CCCP抑制線粒體蛋白輸入或透過寡黴素抑制F0/F1-ATPase引發應激的情況下，OMA1對DELE1的切割能夠誘導轉錄因子ATF4的啟用，但本研究中，IDF堵塞輸入通道本身並不會透過OMA1-DELE1依賴的整合應激反應 （ISR） 啟用ATF4。
至此可見，之前在酵母和哺乳動物細胞中發現的那些調節或響應蛋白質輸入或OMM完整性的質量控制系統，似乎都與本研究所開發的哺乳動物細胞中的蛋白質輸入阻斷無關。為了解決這個問題，本文研究人員隨後利用蛋白質組學分析，結合實驗驗證，發現IDF–MTX複合體堵塞後，TIM23複合體 （線粒體內膜上的一個重要蛋白質轉運通道，負責將前體蛋白從線粒體基質轉運到內膜或基質中） 的兩個關鍵亞基——TIMM17A和TIMM23的蛋白水平顯著下降，而且這個現象與誘導藥物的藥理作用無關，只是由IDF-MTX複合物所引起的。進一步地實驗發現，TIMM17A和TIMM23的降解依賴於YME1L1 （一種線粒體內的ATP依賴性蛋白酶，屬於AAA ATPase家族，在維持線粒體功能和蛋白質穩態中發揮著重要作用，尤其是線上粒體質量控制和應激響應中） 的活性，YME1L1的缺失會加劇因IDF–MTX堵塞導致的細胞生長抑制，表明在TOM複合物阻斷後，YME1L1活性似乎對這種型別的線粒體應激起保護作用。值得一提的是，研究人員排除了ISR啟用、mTORC1訊號通路以及線粒體與核編碼蛋白失衡等因素對TIMM17A降解的影響，最終確認YME1L1介導的TIM23複合體降解是線粒體蛋白輸入受阻後的直接響應機制，這是首次發現與蛋白質輸入和TIM23通道孔本身直接相關的降解過程，而且TIMM17A和TIMM23的降解是導致進一步蛋白質輸入受阻的關鍵因素，而不僅僅是由於IDF堵塞TOM通道的競爭作用。此外，研究人員還確定了TIMM17A的C末端區域是YME1L1識別的關鍵降解訊號，這個C末端的降解訊號區域暴露於線粒體的膜間隙中，靠近YME1L1的活性位點。此外，YME1L1依賴的TIMM17A選擇性降解並不侷限於MIC60，當使用其他底物時，例如將DHFR融合到含有雙訊號的內膜前體蛋白時，也會發生類似的YME1L1介導的TIMM17A降解。
最後，研究人員更詳細地探究了轉運蛋白通道中IDF-MTX的拓撲結構。實驗結果顯示，IDF–MTX與TOM複合體組分有較強的相互作用，但與TIM23複合體組分的相互作用較弱。此外，透過體外合成IDF並將其與線粒體共孵育的實驗，研究人員發現IDF的N端能夠進入線粒體基質，但TIM23複合體並未被堵塞。進一步實驗結果證實，IDF–MTX主要堵塞了TOM通道，而TIM23複合體並未被直接堵塞。然而，由於IDF的N端跨膜段進入內膜，TIM23複合體的功能受到間接影響，無法被其他前體蛋白進入。
綜上所述，本研究開發了一種可以堵塞哺乳動物細胞中的TOM通道的IDF–MTX穩定複合體，深入探討了線粒體蛋白質輸入受阻後的細胞響應機制，發現在正常情況下，線粒體前體蛋白可透過TOM和TIM23輸入線粒體；而當TOM通道被堵塞時，YME1L1能夠識別未被佔據的TIM23複合體，並降解其組分TIMM17A和TIMM23，從而防止進一步的前體蛋白輸入，利於細胞生存（圖2）。本研究結果揭示了YME1L1在維持線粒體質量和細胞健康中的關鍵作用，不僅增進了人們對線粒體蛋白質匯入質量控制的理解，還為研究線粒體相關疾病提供了新的視角，為線粒體生物學和相關疾病研究提供了重要的理論基礎和實驗依據。
圖2 YME1L1介導的TIM23通道降解模型
原文連結：https://doi.org/10.1038/s41556-024-01571-z
製版人：十一
參考文獻
1. Yamano, K., Kinefuchi, H. & Kojima, W. Mitochondrial quality control via organelle and protein degradation.J. Biochem.https://doi.org/10.1093/jb/mvad106 (2024).
2. den Brave, F., Pfanner, N. & Becker, T. Mitochondrial entry gate as regulatory hub. Biochim.Biophys. Acta Mol. Cell. Res.1871, 119529 (2024).
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