近年來，受自然界中摺疊生物聚合物的啟發，化學家們開始探索開發具有可程式設計三維形狀和聚集傾向的天然和非天然肽或核酸序列，以建立複雜的人工系統。這一領域的起步可追溯至約30年前，當時開發出能夠摺疊成穩定的三維構象的小型人工肽序列。為描述這些序列以及任何在溶液中摺疊為構象有序狀態並由非相鄰單體單元之間的非共價相互作用穩定的離散合成寡聚體，術語“摺疊聚合物”被創造出來。隨著非自然氨基酸的引入，這些人工生物分子有望穩定特定的幾何構型和超分子結構。這些摺疊聚合物不僅揭示了自然蛋白質相互作用的關鍵方面，還構成了能夠執行特定功能的人工系統的骨架，廣泛應用於奈米技術和醫學科學等領域。
然而，與此相比，碳水化合物（也稱為糖類或多糖）在構建可程式設計體系結構方面的潛力尚未得到充分開發。儘管碳水化合物擁有多種單糖、多個羥基和手性中心，可提供多種選擇，但迄今為止，這些獨特的特性在材料科學和超分子化學中受到了較少關注。此外，碳水化合物的合成複雜耗時，自動化技術相對較少，這給摺疊聚合物和超分子系統的開發帶來了挑戰。然而，近年來，隨著自動化技術的採用和糖類合成的進步，人們對糖類的認識從具有不明確構象的分子轉變為分子採用數個由低能量障礙分隔的構象，這為糖類在材料科學和超分子化學中的應用提供了新的可能性。
2024年2月5日，德國波茨坦馬克斯·普朗克膠體與介面研究所的Martina Delbianco等人探討了可程式設計碳水化合物結構在合成和分析方面取得的突破，這些突破使得設計人工糖類摺疊聚合物和組裝體成為可能，並討論了該領域的未來前景，分析了必須克服的挑戰，以建立建立碳水化合物材料按需設計規則。該綜述以“Towards glycan foldamers and programmable assemblies”為題，發表在Nature Reviews Materials上。
【糖類結構的不同層次】
首先，糖類的主要結構由糖類中單糖的序列（包括糖苷鍵的位置和立體化學）定義。糖苷鍵的構象空間由立體電子學確定，而由於高能共軛（例如外異構效應和 gauche 效應）、分子內氫鍵和空間效應，確定了糖苷鍵的構象，從而定義了糖類的次級結構。水對摺疊過程至關重要，因為它與分子內氫鍵競爭，影響相對 rotamer 的分佈，使得糖類成為非常靈活的分子。然而，這種靈活性促使了廣泛的誤解，即這些生物分子沒有明確定義的形狀，並且只有在高聚合度時才會摺疊成螺旋或帶狀結構。然而，一些糖類（如富含巖藻糖的抗原，例如Lewis X (LeX)）的情況下，多種相互作用的貢獻可以生成相當剛性的幾何結構。此外，糖苷鍵的立體電子學、l-巖藻糖的甲基基團與d-半乳糖的β面之間的疏水相互作用，以及相鄰的GlcNAc基團的立體位阻進一步促使該封閉幾何結構的穩定。類似的非傳統氫鍵在其他相對剛性的糖類結構中也曾在實驗證明，例如寡半乳糖。透過多種弱分子內相互作用使這些糖類片段變得剛性，可以啟發設計其他摺疊成定義的次級結構的人工主要基元。
此外，糖類還可以參與多種分子間相互作用，包括氫鍵、糖類-芳香相互作用、疏水相互作用、範德華力相互作用和與金屬離子的配位，從而生成組裝體和層次結構。這些相互作用指導了結晶材料（如纖維素和殼聚糖）、螺旋超結構（如卡拉膠和β-葡聚糖）以及包含複合物（如糊精-碘複合物）的形成。然而，這種多重分子間相互作用的趨勢在自組裝糖類寡聚體的設計中很少被重現。
在這一部分，我們審視了導致對糖類結構不同層次的更深入瞭解的成就。由於新的合成平臺，具有明確定義組成（即主要結構）的糖類序列變得可行。這些化合物具有均勻的化學結構，可以包括標籤或報告物質，使它們成為開發新的分析技術的理想探針，以探索糖類構象空間（即次級結構）和聚集傾向。
圖1 | 利用糖類構建可程式設計體系結構的吸引特性。代表性的糖類和肽結構。透過比較可見，與肽相比，糖類可能為生成具有明確定義的三維體系結構提供引人注目且互補的特徵。
【控制主要結構】
合成寡糖和多糖所需的複雜性，包括單糖的正確連線、保護基的使用、多步合成和對反應條件的嚴格控制。傳統的合成方法耗時耗力，需要受過專業訓練的科學家。然而，在過去的二十年裡，出現了幾種自動化技術，能夠可靠地在短時間內合成寡糖和多糖。其中，自動糖類組裝技術（AGA）是一種重要的方法，透過迭代進行糖基化和選擇性去保護，將適當保護的單糖單元連線在固體支援上，從而獲得對長度和單糖序列完全控制的目標多糖。AGA大大縮短了化學合成糖類所需的時間，特別適用於生產相關化合物的集合。此外，AGA還可以引入非經典單糖，從而方便結構分析。
然而，AGA也存在一些問題，如大量使用保護基、難以去除保護基以及技術的可擴充套件性。文章隨後介紹了一種在2022年報道的高效自動溶液相合成器，該合成器基於預啟用多組分方法進行連續乘法合成，提供了一種替代AGA的步進式延伸的方法，允許合成長達1,080個單糖單元的多糖。該合成器能夠在克級規模上執行，並且透過使用化學計量的糖基構建單元，並使用線上直接監測反應的進展，克服了其他自動化平臺的一些缺點。
還有一種生物合成方法，如1,6-縮酮糖的陽離子環氧聚合，提出了一種可擴充套件的替代方案，以生產精確的多糖。最後，文章討論了自動酶介導的糖類合成技術，雖然仍處於初級階段，但具有潛力克服化學合成中的保護基要求。總體而言，現在有幾種技術可用於生產具有主要結構控制的精確寡糖，但在糖基化過程中對差向構象的控制，尤其是1,2-順式鍵的形成，對所有自動化方法仍然是一個挑戰。此外，開發具有可程式設計構象的糖類序列也受到適用於快速可靠分析糖類結構的合適分析技術的缺乏的限制。
圖2a| 糖科學中的合成和分析改進。新的可獲取的糖結構，包括長的、單分散的100-聚合物α-1,6-甘露糖苷（1）、1,080-聚合物Araf1080（2）、氟化的β-1,4-寡糖葡萄糖苷（3）和活性陽離子環氧聚合合成的化合物P(OH-l-Glc)（4）。
【理解二級結構】
核磁共振（NMR）譜學作為目前最常用的用於研究糖類在溶液中二級結構的分析技術。儘管NMR譜學提供了一系列的方法，包括二維和三維脈衝序列實驗，來剖析糖類的幾何結構、動態和相互作用，但在複雜的糖類結構中，吡喃糖環或呋喃糖環的1H NMR訊號顯示出有限的變異範圍，往往重疊。這種化學位移的退化和低靈敏度使得對構象和動態分析的關鍵NMR引數的識別變得困難，有時甚至是不可能的。
隨著鈮-鈦合金技術的進步，出現了能夠在1 GHz及以上磁場下工作的超導磁體，結合脈衝序列實驗的提速和硬體增強的信噪比，這些技術進步直接應對了NMR靈敏度和解析度的侷限性。同時，純糖類的庫也因前述的合成方法而變得可用。攜帶同位素標記（13C、15N、2H或19F）或鑭系標籤的化合物在特定位置對NMR分析尤其有用，有助於簡化結構分析。這些庫揭示了相對較短的寡糖（如六糖）可以採用不同構象，其中某些序列更傾向於螺旋結構，而其他序列則更傾向於棒狀結構或較不明確定義的幾何結構。
合成糖類探針、分子動力學模擬和NMR譜學相結合，用於深入解析一些細菌糖類的二級結構，並將其與免疫原性進行相關。這種方法被證明對於鑑定相關帶電多糖的不同尺寸和手性的螺旋構象非常有效，突顯了糖類構象方面的特定生物活性。儘管NMR是一種多功能且廣泛可用的技術，但該技術僅適用於平均集合結果。由於糖類的幾種構象通常受低能量壁壘的分隔，詳細的構象資訊在測量期間會被平均掉。單分子成像技術結合精密的沉積方法，如掃描隧道顯微鏡結合電噴霧離子束沉積（ESI–STM），能夠視覺化樣品中所有單個糖類結構，而不是提供所有構象的集合平均。透過微調軟著陸方法的碰撞能量，可以保留脆弱的氣相構象或探索模型纖維素六聚體採用的整個化學空間。利用功能化的探針進一步提高了成像解析度，使得能夠視覺化單個共價鍵。該方法的挑戰在於探索溶液中的構象以及在表面上直接觀察驅動糖類聚集的相互作用。
透過對明確定義的合成片段進行深入的結構分析，獲得了對天然多糖結構偏好的有價值的見解。隨著合成糖類集合和結構資訊的獲取逐漸便利，引入機器學習方法可能為糖類結構和動態行為提供前所未有的3D理解。共同專案，如Glyco3D72，連線著涵蓋糖類的3D特徵和有價值的NMR資料的資料庫，是至關重要的，並應該透過新的分析技術產生的資料來補充。
【描述組裝】
先進的傳輸電子顯微鏡技術，包括電子層析、微晶電子衍射（microED）和低溫電子顯微鏡，拓展了電子顯微鏡的能力，從輻射敏感的碳水化合物組裝中收集有價值的資訊，提高了對其奈米尺度形態學、分散度和區域性結構異質性的理解。例如，電子層析提供了未染色樣本中個體顆粒的高解析度3D資訊，使用高靈敏度探測器進行低劑量成像。低溫電子顯微鏡透過將樣品嵌入玻璃狀冰中，減少輻射損傷，允許在其原生狀態下成像輻射敏感的糖類。
電子顯微衍射和微ED提供了在奈米尺度上獲取區域性結構資訊的途徑，使分子結構能夠與結晶糖類樣品的外部形態相關聯。此外，四維掃描透射電子顯微鏡（STEM）技術捕捉了STEM圖中每個畫素位置處的完整2D衍射圖案，提供了有關材料結構和組成的資料。這些技術的應用為糖類組裝提供了多個尺度上前所未有的見解，並對誘導組裝或自組裝過程的關鍵特徵進行了鑑定和合理解釋。
補充技術方面，掃描電子顯微鏡是評估大於幾微米的碳水化合物組裝的理想技術，因為它提供了與TEM相比更寬的視野。掃描電子顯微鏡用於表徵從酶合成的多糖體中組裝而成的木聚糖微粒，形態可以透過糖基引物的結構進行調節。此外，原子力顯微鏡（AFM）是電子顯微鏡技術的補充，對於糖類材料的成像和分析提供了強大的工具。AFM能夠在液體中分析化合物，並觀察其對外部刺激的結構變化。該技術的成像能力還可以與奈米級紅外光譜相結合，以檢測糖類組裝內的區域性空腔和溶劑積聚。透過AFM，還能夠揭示離子結合卡拉膠多糖的分層組織，這些高度硫酸化的糖類根據離子型別和濃度經歷多種離子誘導的自組裝過程，形成手性超分子結構。
總體而言，這些電子顯微鏡和AFM研究主要對天然多糖進行了表徵，這些多糖通常具有可變的尺寸分佈。將這些技術應用於明確定義的寡糖組裝將填補知識空白，既更好地瞭解天然糖類，又有助於設計人工糖類系統。透過系統地運用這些方法研究其他合成系統，我們將對糖類的複雜行為獲得有價值的見解。
圖2b-d| b，掃描隧道顯微鏡與電噴霧離子束沉積（ESI–STM）成像單個糖分子在軟碰撞時的影象。c，酶合成的木聚糖微粒及其可調控形態的代表性掃描電子顯微鏡（SEM）影象。d，離子結合卡拉膠多糖的從一級到四級結構的分層組織和代表性原子力顯微鏡（AFM）高度影象。
【走向可程式設計糖類結構】
發現碳水化合物能夠在低能壘條件下采用多個定義明確的次級結構，這表明可以實施化學策略來穩定某一構象。同樣，可以精心設計寡糖鏈來調控糖的聚集，並實現可程式設計的超分子組裝。在這一部分，我們重點介紹了為糖摺疊體和組裝體制定合理設計原則的關鍵里程碑。
糖摺疊體：透過系統改變主要序列和使用非常規氨基酸，人們成功地獲得了能夠穩定摺疊的短肽。受到肽摺疊體豐富文獻的啟發，設計了一種糖摺疊體，能夠自發地摺疊成剛性次級結構。透過連線兩個天然糖結構單元，一個剛性彎曲和兩個堆疊鏈，產生了一種糖髮夾 - 一種在自然界中從未發現的幾何形狀。未來，透過其他單糖、糖結構單元和非常規殘基的組合，可能會實現更多構象。控制糖的構象能力將有望導致可預測的功能和性質，應用於催化和奈米技術。
糖組裝體：合成的糖組裝體在文獻中並不常見。這些例子中，糖的特定特徵，如親疏性、手性和能夠進行多向氫鍵的能力，已被利用來引導聚集過程。透過一些糖的兩性親疏性，有時還引入非天然芳香基團，推動了從纖維到顆粒的超分子形狀的組裝。改變糖的立體化學（即氫氧基團的取向）可以微調導致自組裝行為和合成糖肽的C−H···π相互作用。糖的固有手性也被用來在超分子組裝體中從分子水平到微觀水平引入不對稱性。這些系統證實了立體化學、糖苷鍵的型別以及共價連線的糖組分的親水性到疏水性平衡對形態的重要性。透過引入離子功能基團，可以探索透過庫侖相互作用穩定摺疊並透過pH改變來觸發（或破壞）摺疊的方法，這對於響應性糖材料是一種有用的工具。迴圈寡糖可能是構建基於糖的體系的有趣合成目標，能夠容納疏水客體。可用的功能化天然環糊精的方法、非常規大環的形成以及線性糖的釘扎等方法可能推動這類系統的生產。
圖3 | 獲取人工糖摺疊體和組裝體的設計原則
【展望】
科學家從自然界汲取靈感，創造了能夠形成明確定義的3D結構的合成類似物。迄今為止，這些化合物主要基於肽和核酸，這些在分子水平上很好理解並且容易合成。20種氨基酸和四種核鹼，再透過非經典殘基擴充套件，使得可以生成能夠採用明確定義的次級結構並組裝成超分子結構的寡聚體。儘管最初這些序列受到自然界中類似物的啟發（如膠原蛋白和澱粉樣蛋白），但該領域已經發展到可以透過計算程式輔助設計完全人工結構的程度。
我們相信碳水化合物的潛力遠未充分發揮。超過100種單糖的選擇，可以透過非經典殘基進行擴充套件，為結構設計提供了幾乎無限的可能性。技術進步已經使得能夠合成大量受序列控制的長鏈糖，新的關於糖結構的認識表明，糖可以被程式設計以建立可摺疊和可調形狀的摺疊體和材料。該領域仍處於初級階段，需要更多的化學反應、建模技術和結構資料來建立可靠的設計原則。最終，合成、建模和分析之間的強烈協同作用應該提供一個工具箱，用於按需生產糖類結構。
目前大多數分析技術都是靜態的，只能提供對最多型的資訊。將單分子分析技術擴充套件到研究更多的糖類將是糖類研究領域的一個重要里程碑，揭示出否則看不到的構象。透過快速冷凍糖樣品，可以用NMR譜學來捕捉非平衡的瞬態狀態，並在過去的蛋白變性研究中展示了對低佔用構象的洞察。標記的糖是提高糖NMR訊號的關鍵。將常用於複雜生物材料表徵的分析方法，如小角X射線散射和聚焦離子束掃描電子顯微鏡，應用於合成糖類組裝體的分析，這些方法可以在數十奈米的解析度下分析結晶糖類組裝體的大小分佈、形狀、方向和結構。表面紅外和掃描探針顯微鏡可以用於表徵表面性質，如化學結構、親水性或疏水性，以及人工糖類系統中離子基團的位置。
公開可用的神經網路平臺，包括RoseTTAFold和AlphaFold2，已經顯示出人工智慧體系結構可以將1D、2D和3D資訊相互連線，使網路能夠集體推斷蛋白質的化學和摺疊結構之間的關係。我們設想類似的基於人工智慧的網路將出現在糖類中，能夠根據大小和形狀的個體需求提出糖化學序列的建議。
類似於發現基於肽的摺疊體如何開創了一個新領域，我們預期糖摺疊體和組裝體可能在材料科學、生物學和催化等領域找到應用。精確的寡糖已經被探索用於構建具有可控表面和尺寸的奈米材料。糖摺疊體可以啟發設計新型的糖類仿生藥物，提高其對酶降解的穩定性和/或最小化與目標蛋白結合的熵懲罰。我們設想還可以將其用於化學感測器、酶催化轉化的催化劑和生物基質模擬體的模擬。這些應用很大程度上受到肽領域的啟發，但隨著對糖摺疊體和組裝體設計的認識增加，可能會揭示更多的機會。最後，糖摺疊體和組裝體的設計是增加我們對碳水化合物結構及其與自然界中其他分子相互作用的理解的引人挑戰。這一領域的進展將推動合成和分析化學的界限。
圖4 | 糖摺疊體和組裝體的未來展望
https://doi.org/10.1038/s41578-023-00638-x
來源：BioMed科技
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