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詳解丨基因KO了,蛋白還殘留?

2024-11-03 19:01:21

構建基因敲除(KO)細胞時,明明DNA測序已經產生了移碼的indel,但用Western Blot檢測蛋白還是不理想,到底是什麼問題呢?

圖1 敲除前後,WB條帶無差異

1. 首先考慮抗體特異性。

在評估基因過表達或干擾效果時,抗體能夠檢測到條帶差異即可,對於非特異性條帶的容忍度較高。然而,對於確認基因是否被完全敲除,非特異性條帶的問題變得尤為關鍵。因此,採購抗體時注意檢視該抗體是否經過KO驗證。

2. 核查敲除方案可覆蓋的基因轉錄本情況。

透過NCBI、ensemble或UCSC等資料庫檢視該基因轉錄本,核對敲除方案是否完全覆蓋。如果有未覆蓋的情況,轉錄本產物和WB條帶是否能對應上?——儘可能採用片段敲除方案,覆蓋更多轉錄本,在產生非3倍數indel的同時破壞基因更大的片段。

3.核查基因本底表達水平。

如果基因本底表達量很低,可能導致目標蛋白本身無法透過WB檢測到,而WB結果上的條帶均非目的條帶,無法分析敲除前後的變化情況,影響結果判斷。

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