嵌合性抗原受體（Chimeric antigen receptor,CAR）是一種人工合成的免疫受體，整合了抗體的抗原識別區，T細胞抗原受體（T cell receptor,TCR）的訊號區，以及共刺激分子的訊號區。利用基因工程方法在T細胞中外源表達CAR後，產生的CAR T細胞可以針對特定抗原產生免疫應答反應。CAR T細胞治療已經獲批用於治療，在自身免疫病中也展示了很好的應用前景，未來還可以用於感染、器官纖維化、衰老等多種場景。與天然的受體TCR相比，CAR的抗原敏感性差，並且與其它訊號分子的協同性差。這些劣勢是因為CAR無法像TCR一樣形成成熟的免疫突觸來整合各條訊號通路。這些訊號的劣勢會導致CAR T細胞無法清除抗原表達量低的靶細胞，並且容易發生功能耗竭，無法長期工作。最佳化CAR的訊號轉導功能是突破目前CAR T細胞治療臨床瓶頸的關鍵所在。
2024年11月27日，中國科學院分子細胞科學卓越創新中心（生物化學與細胞生物學研究所）許琛琦研究組聯合上海科技大學王皞鵬研究組在Immunity雜誌線上發表了題為Phase separation of chimeric antigen receptor promotes immunological synapse maturation and persistent cytotoxicity的研究論文。該研究在傳統二代CAR分子胞內段引入TCR中的CD3ε元件（E-CAR），並且對CD3ε進行了序列最佳化，提高E-CAR在細胞膜上的穩定性。E-CAR分子可以透過cation-pi相互作用產生液液相分離，幫助免疫突觸的形成與成熟；這不僅增強了E-CAR分子本身的訊號功能，也能招募CD2等共刺激分子，更好地利用內源共刺激訊號。E-CAR T細胞比普通的CAR T細胞具有更高的抗原敏感性，以及更好的持續殺傷能力，在初發腫瘤和復發腫瘤的動物模型中，展示了更好的抗腫瘤功能。目前E-CAR已經進入臨床試驗階段，展示了很好的應用前景。
可相分離E-CAR促進T細胞免疫突觸成熟，從而提高抗原敏感性和細胞長效性
大多數T細胞的TCR主要由抗原識別亞基TCRab和訊號傳遞亞基CD3ed, CD3eg, CD3zz組成。CD3分子富含多處功能序列，可以結合不同訊號分子，發揮各種調控功能。其中，CD3ε 分子的N端是一段鹼性氨基酸富集區（Basic amino acid-rich sequence, BRS），緊接著是一段脯氨酸富集區（Proline-rich sequence, PRS），C 端則由一段包含RK序列的免疫受體酪氨酸啟用基序（Immunoreceptor activation tyrosine-based motif, ITAM）組成。許琛琦團隊和合作者的前期研究發現，當T細胞處於靜息狀態時，BRS與細胞質膜的酸性磷脂發生靜電相互作用，將CD3e的胞內區遮蔽在膜內，防止T細胞產生過強的基底訊號（Xu et al., Cell 2008）；抗原刺激TCR後，鈣離子大量內流，中和酸性磷脂的負電荷，從而打破BRS和酸性磷脂的靜電相互作用，釋放CD3e胞內區（Shi et al., Nature 2013）；CD3e BRS隨後和酪氨酸激酶LCK 發生靜電相互作用，促進TCR-LCK的液液相分離，增強TCR的磷酸化，並進一步促進LCK的活化（Chen et al., PNAS 2023）。磷酸化的CD3e ITAM可以招募抑制性激酶CSK，抑制LCK活性，並打破TCR-LCK相分離，使得TCR訊號迴歸基線，防止細胞過度活化（Wu et al., Cell 2020）。
許琛琦團隊進而將CD3e引入二代CAR分子，設計了功能上更加模擬TCR的第一代E-CAR。在本論文中，團隊發現E-CAR 1.0的胞內訊號區自己就能夠形成液液相分離，而傳統二代CAR分子的相分離現象較弱。這種相分離主要由CD3e的鹼性氨基酸和其它訊號區上的酪氨酸所帶的pi電子形成的cation-pi相互作用所介導。在細胞水平，E-CAR 1.0更易於在細胞表面聚集，然而E-CAR在膜上的表達水平比傳統CAR低。因此，團隊透過蛋白序列最佳化，構建了一種E-CAR 2.0版本（B6I），保留了其相分離所需的鹼性氨基酸，並有效地提高了膜表達水平。
28Z CAR, E-CAR 1.0, E-CAR 2.0模式圖
T細胞與靶細胞接觸時形成高度有序的超分子啟用簇（Supramolecular activation cluster, SMAC），成熟的TCR免疫突觸通常是具有“牛眼“樣結構，由TCR形成的central SMAC（cSMAC），由黏附分子LFA-1形成的peripheral SMAC（pSMAC）和富含磷酸酶CD45的distal SMAC（dSMAC）。pSMAC和dSMAC之間還有共刺激受體CD2形成的花冠結構，富含CD28, ICOS等多種共刺激分子和PD-1等共抑制受體，共同調控T細胞訊號。多層有序的免疫突觸結構確保了訊號的有效傳遞。很多研究表明CAR分子不能形成經典的免疫突觸結構，CAR分子形成的通常是不規則的微簇結構，這導致其對抗原訊號傳遞低效和對共刺激訊號利用不足（Gudipati et al., Nat Immunol 2020; Burton et al., PNAS 2023; Dong et al., EMBO J 2020）。與TCR相比，傳統CAR分子只利用了CD3z鏈作為其主要訊號傳遞亞基。其餘CD3鏈的缺失可能導致CAR無法形成成熟的免疫突觸。
由於抗原受體聚集是免疫突觸形成的基礎，E-CAR相分離促進了免疫突觸成熟，不僅提升了E-CAR在cSMAC中的訊號轉導功能，還在外周形成更好的CD2花冠結構，招募PI3K這些訊號分子來介導共刺激訊號。團隊還注意到，E-CAR免疫突觸呈現出訊號先放大後減弱的動態性，與TCR形成的免疫突觸非常相似。
團隊接下來研究了E-CAR T細胞的功能，發現其對弱抗原腫瘤細胞的結合與殺傷都更強。透過建立腫瘤細胞反覆刺激模型，團隊發現E-CAR T細胞的長效殺傷效果更好，在清除腫瘤細胞的同時還可維持自我增殖。RNA測序結果顯示E-CAR T細胞可以利用CD2訊號來緩解功能耗竭，這與其能誘導形成CD2花冠結構這一現象吻合。在血液瘤和實體瘤的初發腫瘤動物模型以及血液瘤復發的動物模型中，E-CAR T細胞都比傳統的細胞表現出了更好的抗腫瘤效果。
綜上所述，這一研究透過蛋白設計，構建了可相分離的新型E-CAR分子，提高了免疫突觸質量，從而提高了抗原敏感性和細胞持續性，在動物模型中取得了很好的疾病治療效果。
（E-CAR胞內段相分離就像睡蓮的根莖交錯纏繞，吸引來的各種小魚意味著成熟的免疫突觸招募了各類下游訊號分子，介導T細胞的免疫應答反應。）
中國科學院分子細胞科學卓越創新中心許琛琦研究員和上海科技大學生命科學與技術學院王皞鵬研究員為本論文的共同通訊作者。分子細胞科學卓越創新中心博士研究生徐心怡，上海科技大學與分子細胞中心聯合培養碩士研究生陳昊天，分子細胞中心博士研究生任正旭，國科大杭州高等研究院碩士研究生徐曉敏為該論文共同第一作者。
https://www.cell.com/immunity/abstract/S1074-7613(24)00520-X
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