論文的通訊作者：葉宇軒
論文第一作者：王輝，高斌
論文通訊單位：西湖大學
論文DOI:10.1038/s41557-024-01671-1
α,β-不飽和羰基化合物在製藥、農藥和材料等多個領域具有重要的作用。在預先構建的分子框架中直接脫氫引入與羰基相鄰的C=C雙鍵是構建α,β-不飽和羰基化合物的理想策略之一。近幾十年來，合成化學家發展了許多催化體系來實現此過程。例如羰基α位鹵化-消除的串聯過程；Saegusa-Ito氧化；高價碘氧化；新型氧化劑 (SeO2、N-叔丁基苯基亞磺醯亞胺氯、IBX和AZADO等) 介導的直接脫氫；過渡金屬催化；電催化等 (圖1a)。然而，目前已有的方法要麼需要多步合成，要麼需要在較強氧化性條件下進行，或使用較高當量的金屬催化劑。更重要的是，目前還沒有一個普適的催化體系，可以在去飽和化過程中實現立體化學的精確控制。這些侷限都限制了直接脫氫去飽和化反應在合成化學中更廣泛的應用。
近年來，酶催化劑因其選擇性控制精確、易於改造進化和綠色環保等獨特優勢，越來越受到合成化學家的關注。自然界中存在一些天然催化羰基去飽和化反應的酶，但它們的底物普適性差，難以作為催化劑被廣泛應用。為了克服這些侷限，西湖大學葉宇軒課題組從一類底物範圍好、熱穩定性高、易於表達的烯還原酶出發，成功把其從還原酶改造成去飽和化酶 (圖1b)，建立了一個通用的酶催化羰基去飽和化反應平臺，合成了一系列含有遠端四級手性中心的高價值環己烯酮產物 (圖1c)。此酶催化反應體系條件溫和、操作簡單、易於放大，展現出與已有的化學合成方法互補的反應性和選擇性。
圖1. 酶催化羰基去飽和化反應。圖片來源：Nat. Chem.
作者首先建立了結構多樣的烯還原酶庫，以4-甲基-4-苯基-環己酮1作為模型底物，在氧氣存在的條件下對ERED的脫氫反應性進行評估，發現CrS和GkOYE表現出較好的活性和對映選擇性控制。當溫度升高時，去飽和化反應性提高 (圖2a)。隨後作者以野生型CrS和GkOYE為起點，利用定向進化技術提高酶催化劑的反應效率。單突變體CrS1 (Y27L)、CrS2 (Y27C)和CrS3 (Y27T)分別以79% (98:2 er), 88% (98:2 er)和81% (97:2 er) 得到產物2；GkOYE-WT經過三輪進化得到一個三重突變體GkOYE3 (D73G、C26S、Y28V)，可以以很高的效率催化2的生成 (96%，>99:1 er) (圖2b)。
圖2. 反應最佳化和定向進化。圖片來源：Nat. Chem.
接著，作者收集了在定向進化中獲得的有益突變體，建立了去飽和化酶庫，並對反應的底物範圍進行了探索。作者首先測試了多種4-烷基-4-芳基取代的環己酮底物，均具有良好的耐受性 (圖3)。當使用含2-氨基苯基的環己酮作為起始原料8時，以99% (>99:1 er, >20:1 dr) 的收率得到環化的產物二氫吲哚酮9。值得注意的是，這種生物催化去飽和化方法對胺和硫醚等氧化敏感官能團表現出高的相容性。此外，缺電子和富電子雜環都是能夠在改反應條件下被相容。除甲基外的各種烷基取代基底物也可以實現高立體選擇性的脫氫。從相應的3-羥丙基底物18出發時，可以99%收率 (>99:1 er，>20:1 dr) 得到環化產物八氫色烯-7-酮19。此外，螺環底物 (20-23) 也能很好地轉化。然而，4-羥基苯基的環己酮24不能被酶催化體系相容，可能是由於該底物是酶的抑制劑。
圖3. 4-烷基-4-芳基環己酮去對稱化脫氫反應。圖片來源：Nat. Chem.
無需進一步的酶工程改造，此去飽和化方法可以輕鬆擴充套件到具有其它取代基團的環己酮底物。二烷基取代的環己烯酮25-33可以被高效去飽和化。對於含有甲基和乙基這兩個差別很小的取代基的底物34，在沒有經過定向進化的情況下仍然能以62:38 er得到目標產物。各類4-羥基-環己酮底物和4-酯基-環己酮底物都可以順利的發生反應。此外，甲氧基51、乙醯氧基52和氰基53取代的環己酮也能被酶相容。單取代的環己酮也能成功地實現去飽和化，以中等至良好的收率和高水平的對映選擇性得到相應的產物54-58。4-羥基-4-炔基環己酮59在該條件下無法反應 (圖4)。
圖4. 其它類別環己酮的去對稱化脫氫反應。圖片來源：Nat. Chem.
此酶催化反應體系條件溫和，操作簡單，可以很容易進行放大。作者首先對模型反應進行了克級規模放大 (6.0 mmol)：使用細胞裂解液可以88% 的產率，>99:1 er獲得產物2，使用凍乾裂解液可以81% 的產率、>99:1 er實現反應 (圖5a)。此外，作者以克級規模高效製備了 (+)-Mesembrine，一種具有血清素再攝取抑制活性的生物鹼。透過酶促去飽和化過程製備的環己烯酮產物2是應用廣泛的合成前體，能夠高立體特異性的轉化為有價值的手性化合物62，或是經歷底物控制的非對映選擇性Diel-Alder反應，生成了帶有三個相鄰立體中心的六氫萘酮63(圖5c)。
圖5. 製備規模合成和產物衍生化。圖片來源：Nat. Chem.
最後，作者對這一反應的機理進行了探索。此脫氫反應的可能機理是 (圖6a): 底物在酶的活性空腔結合後，保守的酪氨酸殘基陰離子 (3的Y169) 對底物進行α-去質子化，形成烯醇中間體Int1。隨後，一種反應機理是經歷路徑A，Int1將β-氫負轉移至FMNox，得到去飽和化的烯酮產物2和FMNhq。此反應途徑與ERED催化的天然還原過程相反，符合微觀可逆性原理。另外一種反應機理是經歷路徑B，Int1與FMNox進行單電子轉移 (SET)，生成相應的α-醯基中間體Int2和黃素半醌FMNsq，然後進行質子轉移 (PT) 和另一個單電子轉移 (SET) 成2和FMNhq。此反應途徑與近期報道的ERED催化的單電子氧化反應類似。最後，在酶催化劑釋放產物2，FMNhq與空氣中的分子氧發生反應，經歷黃素氫過氧化物中間體，形成過氧化氫並重新生成氧化態輔因子FMNox。
基於這個機理模型，作者首先利用氫氘交換實驗 (圖6b) 和基因敲除實驗 (圖6c) 證明了Y169氨基酸殘基對去飽和化反應的重要作用。自由基鍾實驗結果與β-氫負轉移機制一致 (圖6d)。接著，作者對該反應獨特的β-氫負轉移步驟進行了動力學研究，證明了反應的決速步是β-氫負轉移。α-和β-位的動力學同位素效應 (KIE) 與所提出的α-去質子化和β-氫負轉移的反應途徑一致 (圖6e)。動力學實驗表明，定向進化後的突變體GkOYE3的催化去飽和化半反應速度比GkOYE-WT快約57倍，還原反應速度變慢約0.7倍，與氧反應速度比GkOYE-WT快約1.5倍。總體而言定向進化產生的突變體在所有三個關鍵基元步驟中都更適合去飽和化 (圖6f)。
圖6. 提出的機理，氫/氘交換實驗，動力學實驗。圖片來源：Nat. Chem.
總結
葉宇軒課題組成功的解鎖了烯還原酶的全新非天然去飽和化反應性，把它們從還原酶改造成為了去飽和化酶。此創新生物催化去飽和化平臺展現出與已有方法互補的反應性和優越的選擇性，具有較好應用潛力。作者透過系統的機理研究，加深對酶催化去飽和化機理的理解，為此反應體系的進一步發展奠定了基礎。
作者簡介
葉宇軒博士2013年於北京大學化學與分子工程學院獲得學士學位，指導教師為王劍波教授和張豔教授。2018年在美國麻省理工學院獲得博士學位，指導教師為Stephen Buchwald教授。2019–2022年在美國普林斯頓大學和康奈爾大學開展博士後研究，合作教師為Todd Hyster教授。葉宇軒博士於2022年9月全職加入西湖大學理學院擔任特聘研究員，主要研究方向為新型酶催化非天然反應的發展和應用。
葉宇軒課題組現面向國內外招聘博士研究生、博士後、科研助理，歡迎對酶催化感興趣的同學申請。課題組主頁：ye.lab.westlake.edu.cn。
文獻詳情：
Unmasking the Reverse Catalytic Activity of ‘Ene’-Reductases for Asymmetric Carbonyl Desaturation
Hui Wang, Bin Gao, Heli Cheng, Shixuan Cao, Xinyi Ma, Yinjuan Chen, Yuxuan Ye*
Nat. Chem.2024
https://doi.org/10.1038/s41557-024-01671-1
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