新型單細胞測序方法可同時測量細胞分泌和轉錄
據預測，人類細胞會分泌3000多種蛋白質，這其中的細胞因子和生長因子等分泌物會影響細胞的許多關鍵功能。以間充質基質細胞（mesenchymal stromal cells，MSC）為例，其被認為是非常優異的治療劑，因為它們可分泌生物活性因子，包括生長因子、細胞因子和細胞外囊泡，用以促進免疫調節和再生。然而，由於細胞來源和異質性的功能差異，臨床上的不一致性阻礙了以MSCs為代表的細胞療法的轉化應用。達到細胞療法的治療潛力需要了解分泌特定蛋白質的亞群，並最好在單細胞水平上定量蛋白質分泌。因此，開發可將單個細胞的轉錄和分泌聯絡起來得方法，無論是對鑑定蛋白質分泌的新調節機制還是開發下一代細胞療法，都極具意義。
來源：網路
新型研究方法問世
透過開發和使用分泌編碼（secretion-encoded）的單細胞測序（SEC-seq）方法，加州大學洛杉磯分校Dino Di Carlo教授和Kathrin Plath等人利用具有亞奈米腔（奈米瓶）的顆粒來捕獲單個細胞及其分泌物，並同時測量了數千個單間充質基質細胞的血管內皮生長因子A（VEGF-A）的分泌和轉錄組。該研究的資料表明，VEGF-A的分泌在整個細胞群體中是不均勻的，並且與VEGFA轉錄水平的相關性很差。最高的VEGF-A分泌發生在間充質基質細胞亞群中，其特徵在於獨特的基因表達特徵，包括表面標記物白細胞介素13受體亞基α2（IL13RA2），而該標記物可促使該亞群發生富集行為。作者認為，SEC-seq能夠鑑定與特定分泌狀態相關的基因特徵，促進機制研究、分泌亞群的分離和調節細胞分泌方法的開發。相關工作以“Associating growth factor secretions and transcriptomes of single cells in nanovials using SEC-seq”為題發表在Nature Nanotechnology。
【文章要點】
在該研究中，作者開發了分泌編碼的單細胞測序（SEC-seq）方法，其將微流體液滴乳液中的微型水凝膠顆粒（奈米瓶）和單細胞RNA測序（scRNA-seq）相結合，確定數千個單細胞的轉錄組和分泌資訊。為此，作者首先研究了一些基本問題：一是可以在奈米瓶上檢測到單個活MSC的VEGF-A分泌；二是載有細胞的奈米瓶乳化後可用於scRNA-seq；三是來自這些細胞的轉錄物和寡聚條形碼可以被量化。此外，為了製備奈米瓶，作者採用了在流動聚焦裝置中使用明膠和四臂PEG丙烯酸酯的水兩相分離的方法，在該裝置中進行相分離再進行紫外線（UV）交聯即可獲得奈米瓶（圖1）。
圖1奈米瓶的製備
根據上述研究，作者使用奈米瓶開發了流式細胞術相容的單細胞VEGF-A分泌測定法（圖2）。首先，檢測細胞被裝載到明膠包被的奈米瓶中，該奈米瓶可與感興趣的分泌蛋白的捕獲抗體綴合，從而使細胞粘附到奈米瓶腔中並捕獲分泌蛋白。隨後，在用寡核苷酸（oligo）-條形碼檢測抗體標記分泌蛋白後，透過熒光啟用細胞分選（FACS）技術可進一步富集奈米瓶，然後分配用於單細胞文庫製備，最終使用已建立的工作流程進行下一代測序。而對所得文庫進行測序後，即可得到用於下游分析的匹配分泌和轉錄組學資料。
圖2SEC-seq的工作流程
隨後，作者透過探索MSCs中A（VEGF-A）的分泌與潛在轉錄組狀態之間的關係，展示了SEC-seq的實用性。VEGF-A是一種重要的分泌產物，可促進血管生成，並參與許多基於MSC的治療。作者基於同時測量數千個單細胞的分泌和轉錄組的發現表明，多種調節途徑可控制VEGF-A的分泌，這突出了檢測分泌亞群的必要性。該研究的資料揭示了在常氧和缺氧條件下MSCs中VEGF-A分泌的高度異質性，並揭示了新的轉錄定義的亞群，如VRS標記細胞，這是使用SEC-seq才能被揭示的亞群（圖3）。此外，通常人們認為分泌蛋白的轉錄表達通常等同於分泌；然而在該研究中，作者發現，在常氧和缺氧的MSCs中，VEGFA轉錄物和VEGF-A分泌的相關性非常低。這一研究發現可能說明，驅動工程化細胞治療功能的分泌不應僅依賴於提高靶基因的轉錄水平，而是可以受益於分泌相關途徑的構建設計。
圖3富集VRS標記細胞
結論與展望
作者最後指出，在以往的研究中，人們可以同時測量細胞相關蛋白和轉錄組，但無法實現同時檢測分泌物和轉錄組。而該研究提出的單細胞測序方法首次實現了分泌物和轉錄組的同時檢測。然而，作者也指出了研究存在的侷限性：SEC-seq需要直徑小於20 µm的細胞，從而適配35 µm尺寸的奈米瓶；而在裂解瞬間檢測到的細胞信使RNA和在奈米瓶中隨著細胞時間的推移逐漸積累的分泌蛋白之間也存在著固有的時間不匹配行為。儘管如此，使用SEC-seq技術，可以有望解答有關分泌組的關鍵問題，包括哪些細胞分泌特定的蛋白質，蛋白質之間是否存在協調分泌，以及什麼機制在控制著分泌。也就是說，該研究提出的SEC-seq策略大大擴充套件了多組學的邊界。
來源：BioMed科技
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