人類神經類器官 （neural organoids） ，或腦類器官 （brain organoids） ，是一種源於人類多能幹細胞的體外培養神經組織三維模型。如今，這一模型已經發展為對人類腦部發育、進化和疾病相關研究的有力工具。在神經類器官的培養過程中，可以透過使用如形態發生素 （morphogens） 等外源模式塑造因子以誘導產生代表特定腦區的特定細胞型別，而這一類培養神經類器官的實驗方案被稱為制導型方案 （guided protocol） ；反之，若不使用額外的模式塑造因子，而是依賴於類器官的自身模式塑造能力來決定所產生的細胞型別，則為非制導型方案 （unguided protocol） 。
迄今為止，可用於培養人類神經類器官的實驗方案已經有不下數十種。然而，我們依然缺乏對這些不同神經類器官培養方案的全面比較與描述。譬如，我們尚不清楚這些不同的實驗方案所產生的細胞在何種程度上覆蓋人類腦部發育過程中所產生的細胞型別，也並不清楚神經類器官所產生的細胞 （特別是非大腦皮層的神經元型別） 在分子表型層面上與腦部發育過程中對應細胞型別的相似程度。
2024年11月20日，瑞士蘇黎世聯邦理工學院生物系統科學與工程系 （Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich）Barbara Treutlein團隊、德國慕尼黑亥姆霍茲研究中心 （Helmholtz Munich）Fabian Theis團隊以及瑞士巴塞爾羅氏人類生物學研究所 （Institute of Human Biology） 、巴塞爾大學生物中心 （Biozentrum, University of Basel）J. Gray Camp團隊合作於Nature發表文章An integrated transcriptomic cell atlas of human neural organoids。文章共同第一作者為Treutlein研究組高階研究員何志嵩博士 （兼共同通訊作者） 、Theis研究組博士生Leander Dony、以及Camp研究組博後Jonas Simon Fleck博士。在這一研究中，研究人員整合了36組不同的人類神經類器官單細胞RNA測序（scRNA-seq）資料集（34組已發表，2組未發表），共計代表了26種不同的人類神經類器官培養方案，合計細胞數量超過170萬。透過對這些資料進行整合分析，並建立了其與人類腦部早期發育細胞圖譜的資料對映關聯，研究團隊對不同神經類器官培養方案所得到的神經元型別、其分化成熟程度、以及與相對應的人類腦部神經元之間的轉錄組差異等進行了全面的分析研究。同時，研究團隊建立了全套的應用程式介面以供其他研究人員將該細胞圖譜運用於其他研究，包括對新建立的神經類器官培養方案進行鑑定評價、對利用神經類器官進行疾病建模的單細胞RNA測序研究資料進行協助註釋、並作為大規模對照實驗組以進行量化比較。
在這一研究中，研究團隊首先利用Sfaira系統對所獲取的海量資料 （包括其元資訊） 進行了統一的標準化處理。由於這些資料來源於不同實驗室運用不同的單細胞RNA測序手段對基於不同實驗方案的類器官進行的測量，因此具有高度異質化、且帶有強批次效應的特點。為了更好地對資料進行整合，研究團隊建立了一套資料整合策略，首先運用資料降維轉化方法reference similarity spectrum【1】，進行資料預整合及聚類，然後利用新開發的基於多層次細胞型別基因標記的自動註釋演算法snapseed進行細胞聚類的預註釋，最後使用基於 （variational autoencoder） 的標籤感知的資料整合演算法scPoli方法【2】結合預註釋的結果進行最終的資料整合。基於最終的整合結果，研究團隊進一步對神經類器官細胞圖譜 （HNOCA，Human Neural Organoid Cell Atlas） 進行細胞型別註釋。
圖1 構建人類神經類器官細胞圖譜HNOCA
為了對人類神經類器官與人腦早期發育進行細緻全面的比較，研究團隊對近期發表的人類腦部第一孕期發育的細胞轉錄組圖譜【3】透過scANVI演算法【4】進行了重新整合處理，並透過遷移學習演算法scArches【5】將HNOCA中的細胞對映到人腦早期發育細胞圖譜的細胞狀態潛在空間中。在此基礎上，研究團隊開發了基於參考-查詢加權k近鄰二分圖的分層標籤轉移方法，對HNOCA中的細胞、特別是非端腦神經組細胞與神經元進行了更細緻的註釋。同時，透過對所得到的參考-查詢加權二分圖進行歸納，研究團隊還得以量化人類腦部早期發育中不同的細胞型別在不同神經類器官實驗方案中的富集程度，從而找到了當前代表性神經類器官培養方案難以有效獲得的細胞型別，其中包括了各種非神經外胚層發生的膠質細胞 （如微膠質細胞、血管內皮細胞等） 以及如丘腦網狀核GABA能神經元、背側中腦m1區GABA能神經元、m1/m2區穀氨酸能神經元等若干神經元型別。同時，透過將HNOCA與人類腦部不同發育時期的細胞圖譜進行比較，研究團隊還發現了在不進行異種移植的前提下，當前的神經類器官的神經元成熟程度存在明顯瓶頸，即便進行超過半年乃至近一年的長期培養，其分化以及成熟程度依舊停留在原生胚胎髮育的第二孕期。
圖2 人類神經類器官圖譜與人腦胚胎髮育圖譜的細胞型別匹配與比較
在協調並標準化人類神經類器官以及人腦胚胎髮育圖譜的神經元型別註釋後，研究團隊進一步對神經類器官與腦部胚胎髮育過程中對應的神經元型別進行了轉錄組差異表達分析。研究團隊得到了920個普遍差異表達基因，即在基於不同類器官實驗方案的不同的神經元型別中均檢測到的差異表達基因。其中，在類器官中表現出普遍高表達的基因顯著富集於糖酵解等代謝過程中，顯示出體外培養環境可能對類器官中細胞的代謝狀態產生顯著影響。這一發現與之前若干研究的發現吻合，而這一變化可能與細胞在非體內培養環境中，特別是由於缺少了血管系統的緣故，所受到的環境壓力相關。而透過將所得到神經元的糖酵解通路活性與不同實驗方案的實驗步驟進行比較，研究團隊觀察到若干實驗操作，如在培養過程中對類器官進行分切、使用特定的神經元成熟培養基等，可能能夠有效降低類器官中細胞對環境壓力產生的應激反應。同時，研究團隊還發現，類器官中神經元應激反應的強弱與其跟早期發育腦部對應神經元型別的核心特徵相似程度並沒有顯著關聯，說明這一應激反應可能並沒有顯著影響不同型別神經元核心分子特徵的建立。
人類神經類器官細胞圖譜HNOCA的構建不僅可以用於對已有資料的整合分析，還可以作為大型資料資源用於協助分析新的神經類器官單細胞轉錄組資料。例如，研究團隊對近期預印於bioRxiv的利用人類神經類器官進行大規模形態發生素篩選實驗的單細胞RNA測序資料【6】進行了再分析，透過將其投影到HNOCA以及人腦胚胎髮育圖譜中，對其中不同的形態發生素處理條件的神經元型別產出進行了量化描述，並於HNOCA中所涵括的已有類器官實驗方案產出進行了比較。
鑑於神經類器官越來越廣泛地被應用於構建神經相關疾病模型，研究團隊還收集並整合了11組單細胞RNA測序資料，涵括了運用神經類器官對包括頭小畸型 （microcephaly） 、肌萎縮側索硬化症 （ALS） 、自閉症 （autism） 、脆性X染色體綜合徵 （fragile-X syndrome） 等10種不同的神經相關疾病進行建模的研究。透過將該整合疾病模型資料集與HNOCA以及人腦胚胎髮育圖譜進行比較，研究團隊對這些疾病模型的單細胞RNA測序資料進行了重新註釋。研究團隊發現，在逾半數的研究中，對照組與疾病組的類器官產生了代表完全不同腦區的不同型別神經元；這意味著對其進行直接的比較很可能無法得到與疾病本身真正相關的基因表達差異。為此，研究團隊基於疾病模型資料投影得到的HNOCA的參考-查詢加權k近鄰二分圖，為疾病模型資料中的每一個細胞構建一個對應的HNOCA匹配元細胞 （metacell） ；然後，透過結合新開發的單細胞配對差異表達統計檢驗，研究團隊建立了一套新的分析體系，在保證計算量的可伸縮性的前提下，讓HNOCA成為一個可供其他研究使用的大規模的對照組單細胞轉錄組資源。研究團隊將這一分析體系運用到其中的脆性X染色體綜合徵研究資料中，併成功找到了與該疾病相關的基因，從而展示了這一分析方法的可行性。
圖3 神經疾病模型類器官圖譜以及與HNOCA的量化比較
而對於其他未包含在當前HNOCA圖譜的神經類器官資料、以及未來可能產生的新資料，研究團隊還開發了HNOCA-tools這個Python的軟體包，可用於將研究團隊所建立的分析方法用於新的資料。該研究中所構建的HNOCA資料可以透過CELLxGENE Discover進行訪問，同時這一資料以及其投影模型均可以透過Zenodo進行下載。此外，對HNOCA的圖譜以及人腦胚胎髮育圖譜的投影還可以透過ArchMap （ https://www.archmap.bio/ ） 選取對應的投影模型來進行。
圖4 用於分析神經類器官單細胞RNA測序資料的分析流程與使用者介面
綜上所述，這項研究透過整合不同神經類器官實驗方案的單細胞轉錄組測序資料，構建了迄今為止最完整最大規模的人類神經類器官細胞轉錄組圖譜，並與人腦早期發育細胞圖譜中的細胞型別與狀態進行了全面比較；同時，這項研究所得到的細胞圖譜以及建立的分析流程框架，也為後續人類神經類器官的單細胞組學研究提供了重要的資料資源與分析流程的參考。
https://www.nature.com/articles/s41586-024-08172-8
製版人：十一
參考文獻
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6. Amin ND, Kelley KW, Hao J, Miura Y, Narazaki G, Li T, et al. Generating human neural diversity with a multiplexed morphogen screen in organoids.bioRxiv.2023. p. 2023.05.31.541819. doi:10.1101/2023.05.31.541819
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