鹽析效應是指透過新增鹽，使溶質從其水介質中分離的一種現象，這種低成本分離技術已有兩個多世紀的工業應用歷史。在水溶液中，溶質透過氫鍵或偶極-偶極相互作用與水結合形成水合物。當鹽加入溶液後，鹽會解離為水合離子，與溶質競爭性地爭奪水分子，導致溶質脫水並與水分離。如果溶質是聚合物，這一過程通常會導致聚合物沉澱或形成凝膠，但在某些情況下會引發液-液相分離（LLPS），生成富含聚合物的液滴。目前，LLPS 產生的液滴或凝聚體因其多相結構特性，已被廣泛研究與生命起源和原始細胞相關的背景。然而，LLPS 的潛力作為一種實用分離技術尚未被充分探索。
在此，東京大學相田卓三(Takuzo Aida)教授和Hao Gong博士報道了在固液介面處的特定液液相分離可以將幾乎相同結構的DNA分配成同心圓。當將含有不同末端（PEG）樣品的硫酸銨水分散體滴鑄到玻璃表面時，即使PEG部分的分子量相同，它們也會在固液介面競爭性擴散並形成微米級同心圓。這一現象是由玻璃表面自發形成的硫酸銨層引起的。基於這一機制，作者成功將幾乎相同的DNA混合物分配成同心圖案，並利用鹽析效應從人類致癌單核苷酸變異的1:1混合物中分離出純度高達97%的DNA，展示了這一方法在精準分離中的潛力。相關成果以“Near-identical macromolecules spontaneously partition into concentric circles”為題發表在《Nature》上，Hao Gong為一作兼通訊。
Hao Gong 和 相田卓三
值得一提的是，這是相田卓三教授課題組近半個月內的第二篇正刊！
PEG 透過 DLLPS 進行同心分割
在研究含硝基苯並惡二唑（NBD）的PEG鹽析行為時，作者發現了一種獨特的同心分配現象。在高濃度(NH₄)₂SO₄溶液中，PEG分子透過兩次液-液相分離在固液介面形成微米級同心圖案（圖1a）。首先，PEG在溶液中形成初級液滴，隨後液滴在玻璃表面因鹽層誘發二次分離，生成富含不同PEG的環和核心（圖1b）。最佳化工藝後，即使分子量高達500,000 Da的PEG也能實現這種分配模式（圖1b(iii)）。更有趣的是，多種PEG混合物（如熒游標記和非標記PEG）也能被快速、高效地同心分配（圖1b(i)–(vi)）。飛行時間二次離子質譜（TOF-SIMS）進一步證實了熒光環和非熒光核心中PEG分子的存在。這一發現展示了DLLPS技術在快速分配結構相似分子中的潛力，為分離技術和材料設計提供了新方向。
圖 1：將幾乎相同的大分子劃分成同心圓
同心分割槽結果
研究發現，MePEG5KNBD和MePEG5KRhB的混合物在不同比例下會形成獨特的同心圖案。當MePEG5KRhB比例增加時，核心逐漸擴大，最終在100% MePEG5KRhB時形成帶有橙色熒光的實心圓（圖2a）。同樣，100% MePEG5KNBD條件下也會形成實心圓，說明這種同心圖案是兩相在固液介面競爭擴充套件的結果，而非單一組分的簡單行為疊加（圖1a，步驟2-2）。擴充套件動力學分析表明，外圍的MePEG5KNBD擴充套件速度更快，而核心的MePEG5KRhB擴充套件較慢（圖2b, 2c）。此外，在二次液-液相分離過程中，兩種PEG在初級液滴中均勻分佈，但在固液介面逐漸被分離到各自的富集相，形成清晰的層狀結構（圖1a, 下插圖）。這一過程為複雜圖案的形成提供了重要的機制理解。
研究發現，在將水性兩相分散體滴鑄到玻璃表面後，(NH₄)₂SO₄鹽層會自發形成（圖1a，步驟2-1）。透過石英晶體微天平（QCM-D）測試，我們驗證了(NH₄)₂SO₄的吸附行為。實驗顯示，當流體從純水切換為26.4 wt%的(NH₄)₂SO₄溶液時，吸附質量迅速增加並在300秒內達到穩定水平（圖2d）。進一步分析表明，玻璃基板上的(NH₄)₂SO₄層非常薄，僅佔總用量的0.0018%（圖2d）。接下來，將包含MePEG5KOH的PEG液滴分散體流入含有(NH₄)₂SO₄的流動模組中，發現其沉積模式與鹽溶液流動後的沉積行為一致（圖2d）。相比之下，若沒有(NH₄)₂SO₄，即使長時間流動PEG溶液，沉積量也僅略有增加（圖2d）。這表明(NH₄)₂SO₄鹽層的存在促進了PEG液滴的沉積、二次LLPS以及隨後的競爭性擴散，從而形成獨特的圖案結構。
相行為對於配分至關重要
研究表明，富含PEG的相根據其與(NH₄)₂SO₄的親和力競爭性擴散，決定了同心圖案的形成順序（圖1a，底部插圖）。雙節曲線和聯絡線的分析結果顯示，不同末端的PEG對(NH₄)₂SO₄的親和力順序為MePEG5KNBD > MePEG5KRhB > MePEG5KNH2（圖2e，上圖）。這一順序在低濃度範圍內的雙節曲線中也得到了驗證（圖2e，下圖）。根據表面潤溼理論，親和力越強的PEG會擴散得越多，形成外層的圖案（圖2e，下插圖）。進一步研究不同分子量的PEG發現，其親和力順序為MePEG5KNBD > HPEG10KOH > MePEG20KNBD > HPEG35KOH（圖2f）。MePEG5KNBD表現出最高的潤溼性，而HPEG35KOH最低。同心圖案的出現順序（圖2f，插圖）與(NH₄)₂SO₄親和力順序完全一致。這些結果揭示了(NH₄)₂SO₄鹽層透過調控PEG擴散行為驅動同心圖案的形成機制。
圖2：同心分割槽的機理研究
核酸呈同心分佈
研究表明，即使是核酸也能透過同心分配進行選擇性提取。當染料修飾的單鏈DNA和RNA（如FAM和TAM）在同心分配條件下處理時，它們會被清晰地分離（圖1c）。此外，透過鹽析效應，還可以從未標記的DNA混合物中選擇性提取特定序列的DNA。例如，在1:1混合的人類癌症相關DNA-1和其單核苷酸突變體DNA-2的樣本中，儘管CLSM無法直接觀察其同心圖案，但利用分配-提取過程，DNA-1可在提取物I中富集至72%，而DNA-2在提取物II中富集至63%（圖3b）。透過重複提取過程，DNA-1的純度可進一步提高到97%（圖3b，左下），而DNA-2經過七次提取後純度也達到了90%（圖3b，右下）。相比之下，如果DNA-1和DNA-2未經過同心分配，隨機沉積後提取時則無法實現選擇性分離。類似的結果也適用於3端含單核苷酸突變的DNA樣本，證明該方法在不同核酸混合物中的適用性（圖3a）。這些結果展示了同心分配結合鹽析效應在核酸分離和選擇性提取中的潛力。
圖 3：透過鹽析效應選擇性提取同心分配的 DNA
雜交後視覺化分割槽
研究表明，透過附加染料的短DNA標籤進行後雜交，可以驗證同心分配的DNA分佈模式（圖4a）。作者使用了與DNA-(1)和DNA-(2)互補的熒光標籤Tag1和Tag2處理DLLPS沉積物。結果顯示，Tag1使外圍發光更亮（圖4b，左），Tag2則使核心形成實心圓（圖4b，右），表明核心富含DNA-(2)，外圍富含DNA-(1)。進一步實驗中，將FAM和TAM標記分別新增至DNA末端後，處理的混合DLLPS沉積物顯示清晰的同心圖案：核心為洋紅色，外圍為黃色（圖4d）。此外，無論DNA是否標記，透過分配提取操作，都可以從DLLPS沉積物中分別提取到DNA-(1)和DNA-(2)（圖4c）。這些結果證實了DLLPS同心分配的準確性和可重複性，為DNA分離提供了新思路。
圖 4：雜交後觀察同心分割槽的 DNA 混合物
小結
即使是最先進的分離技術，對於結構相似的大分子分離仍然充滿挑戰。然而，本文發現DLLPS誘導的同心分配為分離僅因單個核苷酸突變而不同的人類基因片段提供了一種新方法（圖注）。DNA和RNA作為遺傳資訊的載體，這項技術不僅能檢測突變體，還能高效分離，為生命科學的基礎研究提供了新工具。由於DLLPS過程具備自動化潛力，這一突破有望透過微流體技術進一步最佳化，推動相關領域的發展。
來源：高分子科學前沿
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