引言
核酶是具有多種功能的催化RNA，包括自剪接和聚合。這項工作的目的是發現作為水解和序列特異性DNA內切酶的天然核酶，它可以被重新利用作為DNA操作工具。
2024年2月2日，清華大學生命學院劉俊傑(Jun-Jie Gogo Liu)團隊在Science線上發表題為“Hydrolytic endonucleolytic ribozyme (HYER) is programmable for sequence-specific DNA cleavage”的研究論文，在細菌II-C組內含子中，該研究發現許多沒有內含子編碼蛋白的系統在其駐留基因組中繁殖多個複製。這些內含子，被稱為水解核內溶核糖酶(HYERs)，裂解RNA，單鏈DNA，雙鏈DNA (dsDNA)和體外質粒。
HYER1在哺乳動物基因組中產生dsDNA斷裂。冷凍電子顯微鏡分析揭示了HYER1的同二聚體結構，其中每個單體包含一個Mg2+依賴的水解口袋，並捕獲與位點(TRS)互補的DNA。包括TRS擴充套件、招募序列插入和異源二聚化在內的合理設計產生了具有更高特異性和DNA操作靈活性的工程HYERs。
許多天然的催化RNA，被稱為核酶，催化多種生化反應，如RNA剪接和聚合。II組(GII)逆轉錄轉座子——特別是它們編碼的內含子RNA——是一種有充分證據的核酶，能夠在基因組的“複製和貼上”逆轉錄轉座子過程中催化酯交換反應。根據內含子RNA的序列和結構特徵，GII逆轉錄轉座子分為A、B和C三類。GII-C內含子的大小僅為GII-A和GII-B內含子的一半，被認為是更古老的。GII內含子通常由六個結構域組成。最大的結構域I (DI)透過與外顯子結合位點(EBS)的鹼基配對促進RNA外顯子識別。結構域II和III (DII和DIII)是結構基序，維持穩定的核酶結構。結構域IV (DIV)通常包含一個編碼內含子編碼蛋白(IEP)的開放閱讀框(ORF)，其中包含DNA內切酶(EN)和逆轉錄酶(RT)結構域。形成RNA剪接核心的關鍵核苷酸位於結構域V (DV)，剪接過程中負責酯交換反應的外溢腺苷(A)位於結構域VI (DVI)。
在逆轉錄過程中，內含子RNA最初以前體RNA形式(pre-RNA)與外顯子一起轉錄。在IEP的輔助下，內含子RNA透過兩個連續的酯交換反應進行自剪接，產生連線的外顯子和分支內含子RNA。然後，分支內含子透過兩步反向剪接插入到繁殖靶點內的DNA義鏈中。隨後，在target-primed逆轉錄(TPRT)過程中，DNA反義鏈被EN結構域切割，啟動IEP的RT結構域合成內含子cDNA。在TPRT後，內含子RNA模板被移除，宿主的DNA修復系統將其DNA複製貼上到繁殖位點。由於序列特異性轉座活性，由IEP和內含子RNA組成的GII逆轉錄轉座子被重新用作細菌基因操作工具Targetron，它可以將內含子序列整合到目標位點以破壞基因功能。
已經發現了缺乏ORF的天然GII逆轉錄轉座子。這些缺乏ORF的GII內含子通常被認為是GII逆轉錄轉座子的“退化和無功能後代”，並且仍然缺乏特徵。迄今為止，廣泛使用的GII內含子資料庫僅列出了42個經生物資訊學分析鑑定的ORF較少的GII- A和GII-B系統。ORF較少的GII-C內含子尚未報道。對公開可用的細菌基因組序列的初步篩選發現許多GII-C逆轉錄轉座子缺乏IEP編碼的ORF。這些內含子中的一些存在於基因組的多個複製中，這表明不含IEP的逆轉錄轉座子可能是活躍的，並且可能透過“複製貼上”機制進行繁殖。
先前的體外實驗表明，在不提供IEP的情況下，含有GII內含子的ORF可以透過水解而不是酯交換作用來識別和切割pre-RNA中的外顯子，產生成熟的線性化內含子核酶。線性化的內含子核酶可以利用水分子攻擊RNA-RNA或DNA-RNA鍵，在EBS互補RNA或DNA修飾的RNA底物上表現出水解內切酶活性)。然而，報道的內含子核酶在純DNA上很少觀察到實質性的水解裂解活性。
這些線索表明，未被表徵的“繁殖”的ORF較少的GII-C內含子，自然不具有IEP，可能除了具有成熟的RNA切割能力外，還具有透過水解來切割繁殖位點DNA的能力。研究人員將這些假設的內含子核酶稱為水解核心溶解核酶(HYERs)。與已報道的內含子核酶透過酯交換作用對DNA顯示出核內溶活性相反。研究人員開始測試假設並發現HYERs。
HYER1的水解DNA裂解（Credit: Science）
在細菌II-C組內含子中，該研究發現許多沒有內含子編碼蛋白的系統在其駐留基因組中繁殖多個複製。這些內含子，被稱為水解核內溶核糖酶(HYERs)，裂解RNA，單鏈DNA，雙鏈DNA (dsDNA)和體外質粒。HYER1在哺乳動物基因組中產生dsDNA斷裂。冷凍電子顯微鏡分析揭示了HYER1的同二聚體結構，其中每個單體包含一個Mg2+依賴的水解口袋，並捕獲與目標識別位點(TRS)互補的DNA。包括TRS擴充套件、招募序列插入和異源二聚化在內的合理設計產生了具有更高特異性和DNA操作靈活性的工程HYERs。
https://www.science.org/doi/10.1126/science.adh4859
責編|探索君
排版|探索君
文章來源|“iNature”
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