“人類基因組計劃”成功測定出人類染色體中30億個鹼基對組成的DNA序列，是人類科學史上的一個偉大工程，與“曼哈頓原子彈計劃”和“阿波羅登月計劃”並稱為“人類三大科學計劃”。 透過該計劃，科學家已經全部解碼人類基因組DNA序列，但是仍然很難原位解析這些DNA序列的活性與功能。活細胞基因組DNA成像可以原位、動態的解析染色體基因組DNA定位和功能，有助於解析染色體的三維組織及其動態資訊，時空揭示活細胞染色體生物學功能，剖析相關疾病的發生機制。
基於 CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats） /Cas9基因編輯技術不僅被廣泛用於基因組DNA編輯，而且融合熒光探針來成像基因組DNA。這些成像探針主要是催化失活的 Cas9 （dCas9） 融合熒光蛋白或sgRNA招募熒光蛋白融合的 RNA 結合蛋白 （例如dCas9-GFP或者MS2-MCP體系） 。然而，這些熒光蛋白都是利用了持續發光的熒光蛋白。未與基因組位點結合的熒光蛋白遍佈整個細胞核，產生背景噪音熒光，嚴重干擾基因組DNA成像的效率。此外，這些持續發光的熒光蛋白通常會聚集在核仁中，產生非特異性核仁訊號，進一步降低了DNA成像效率。
為了解決上述問題，2024年1月31日，中國科學院北京生命科學研究院李幸研究員課題組在Nature Communications上發表了文章Fluorogenic CRISPR for genomic DNA imaging，研發了熒光響應CRISPR(fluorogenic CRISPR, fCRISPR)體系，在活細胞中示蹤染色體的功能。fCRISPR可實現熒光蛋白在標記基因組DNA時發光，而不標記基因組DNA時不發光的條件發光特點，從而解決了傳統的熒光蛋白標記DNA時出現高背景噪音的問題。此外，fCRISPR示蹤了染色體動態的異質性，標記了畸變染色體，並精細觀測DNA雙鏈斷裂和修復過程，揭示染色體修復過程的多樣性。
為了解決CRISPR/dCas9示蹤基因組DNA時背景噪音問題，團隊構建了低背景、熒光響應的fluorogenic CRISPR (fCRISPR） 成像體系。為構建fCRISPR體系，團隊將“熒光蛋白”探針改造成RNA響應的“熒光響應蛋白”，隨後透過CRISPR/dCas9來標記目標DNA(圖1A)。fCRISPR只有在結合到DNA靶標時，“熒光響應蛋白”才會發出熒光，在未結合到DNA靶標時“熒光響應蛋白”會被細胞蛋白酶體降解從而不發熒光(圖1)。因此fCRISPR能夠低背景、高信噪比和高靈敏地追蹤活細胞中基因組DNA位點(圖1)。
基於fCRISPR成像體系，團隊追蹤到各類人源活細胞的染色體，以及不同低複製的基因組DNA位點。此外，fCRISPR應用於多條染色體的正交成像，實時追蹤染色體動力學，監測和對比癌變細胞端粒長度。最後，團隊深入研究了染色體雙鏈斷裂 （DSBs） 及修復的過程，觀察到染色體的重複切割與修復、同源重組修復等事件，時空研究了染色體DNA損傷及其修復後的生命活動。因此，該技術對於研究疾病染色體的生物學機制和病理進展具有重要意義，並未疾病的治療和診斷提供關鍵資訊，也可為基於基因組DNA藥物的靶點篩選提供有力幫助。
綜上所述，fCRISPR為原位解析人體DNA的活性與功能提供了一個高亮、低背景、高信噪比、高靈敏的成像工具。
圖 1. fCRISPR染色體示蹤體系。(a)團隊針對傳統持續發光熒光蛋白在標記DNA時造成的高背景、低靈敏度、低信噪比等問題，建立了高靈敏度fCRISPR示蹤體系。(b-e)fCRISPR（紅色，tdTomato-tDeg探針）降低了未標記DNA的熒光蛋白噪音，提升了DNA標記的信噪比，以實現高靈敏度示蹤染色體。
張鍾軒和榮霄霄為該論文的共同第一作者，李幸研究員為本文的通訊作者。
https://doi.org/10.1038/s41467-024-45163-9
