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基於ctDNA和neomer特徵的無創監測方法為NSCLC提供新的預後評估工具。
肺癌是全球最常見的惡性之一，也是最常見的癌症死亡原因。非小細胞肺癌（NSCLC）約佔所有肺癌病例的80%-85% [1] 。儘管區域性不可手術的NSCLC患者通常會選擇接受化療和放療（CRT）聯合治療，但其預後依然不佳，5年生存（OS）率令人憂慮 [2,3] 。因此，檢測識別微小殘留病灶（MRD）以促使早期預後評估並調整治療方案顯得尤為重要。
迴圈腫瘤DNA（ctDNA）作為由腫瘤細胞釋放到血液中的非侵入性生物標誌物，可用於預測疾病進展 [4] 。然而，ctDNA的極低濃度使得檢測MRD面臨諸多挑戰。此外，研究表明，利用新子（neomers）作為循環遊離DNA（cfDNA）的生物標誌物在MRD檢測中同樣展現出一定潛力[5]。近期，Cancer Medicine雜誌發表了一項研究，採用超靈敏液體活檢方法對474個相關基因進行了靶向測序，旨在探索非侵入性液體活檢在CRT後NSCLC患者中對ctDNA的長期監測潛力以及其對復發風險的評估能力[6]。本文特此整理，以饗讀者。
圖1 研究封面
研究設計及方法
患者招募和樣本收集
2018年5月至2020年11月期間，研究共納入了59例NSCLC患者。研究採用的化療放療（CRT）方案是基於鉑類的雙藥聯合方案，包括順鉑加依託泊苷、卡鉑加紫杉醇或順鉑加培美曲塞（僅限於非鱗狀細胞癌）等組合。研究者在不同的時間點收集外周血樣本，用於透過靶向下一代測序（NGS）分析474個與癌症相關的基因以及全基因組測序。
在排除了在血漿樣本收集時出現疾病進展（PD）事件的患者以及因肝/骨轉移或個人原因而接受化療而非CRT/放療（RT）的患者後，共獲得了44例患者的治療後血漿樣本。研究者在患者PD前的三個不同時間點評估了血漿樣本中的ctDNA狀態：分別為治療期間（TP1：CRT/RT的第四周）、治療后里程碑（TP2：CRT/RT完成後1個月）以及治療後縱向（TP3：CRT/RT完成後3個月）。具體來說，39例患者在TP1時，32例在TP2時，25例在TP3時接受了評估。除了ctDNA結果外，研究者還收集了詳細的病理和臨床反應資料，以供後續分析。患者中位隨訪時間為26.4個月。
Neomer機器學習模型
研究者對WGS資料的原始讀取進行修剪，將處理後的讀取與人類基因組（GRCh37/hg19）進行比對以去除來自參考基因組的常見變異。為構建模型，研究者採用了新定義的neomer特徵。研究者還對PCAWG資料庫進行了調查，從2577個癌症患者樣本中識別出了977個重複出現的單核苷酸多型性（SNPs）。從這些重複的SNP中，我們提取了4616個長度為16個鹼基對的neomer。隨後，使用全基因組變異資料庫（gnomAD v2）將這些neomers與常見的種群變異資料進行過濾，最終得到了1758個neomers。針對每個血漿樣本，掃描FASTQ資料以尋找與1758個目標neomer的16 bp長度完全匹配的序列，並將neomer特徵定義為neomer檢測到的讀取與總讀取數量的比值，以及每個neomer的讀取計數。
為了開發MRD預測模型，44例患者收集了總共97個血漿樣本，包括39個TP1樣本、33個TP2樣本和25個TP3樣本，如圖1所示。針對每個時間點，採用生存支援向量機（sSVM）演算法構建了三個機器學習模型。
圖2 研究佇列和設計流程圖
三個模型均採用留一交叉驗證（LOOCV）策略進行了效能評估。在LOOCV過程中，除了留出的第i個樣本外，對整個資料集構建了N（TP1：39，TP2：33，TP3：25）個交叉驗證模型。使用訓練好的交叉驗證模型，研究者為被排除的第i個樣本預測MRD風險。在獲取所有樣本的風險評分後，透過選擇一個截止值來確定MRD狀態以確保90%的特異性。
關鍵研究結果
患者特徵
在此前發表的結果中，觀察到患者群體幾乎均分為腺癌（ADC）患者（45.5%）和鱗狀細胞癌（SCC）患者（50.9%） [7] 。此外，患者大多數（87.3%）為區域性晚期疾病。
MRD檢測的機器學習模型
既往研究發現，在CRT後各時間點（TP1、TP2和TP3），復發患者的突變總讀取比率顯著高於未復發患者（見圖3）。突變總讀取比率是指突變讀取數與總讀取數的比例。此外，正如預期的那樣，復發患者的癌症訊號在TP1到TP3之間逐漸上升，並且在TP3時，復發患者與未進展患者之間存在統計學顯著差異（p=0.025）。
圖3 不同時間點的neomer特徵模式
neomer模型在不同時間點均表現出一致的高效能。TP1時的模型敏感性為40%（95%Cl，21.1%–61.3%），特異性為92.9%（95%Cl，66.1%–99.8%）。TP2時模型的敏感性為40%（95%Cl，19.1%–63.9%），特異性為92.3%（95%Cl，64%–99.8%）。TP3時模型的敏感性為45.5%（95%Cl，16.7%–76.6%），特異性為92.9%（95%Cl，66.1%–99.8%）。
表1 neomer模型和基於突變的ctDNA方法的效能
此外，sSVM演算法在三個時間點的表現均優於其他演算法，均在目標90%特異性截止值下（如表2所示）。
表2 目標90%特異性下不同演算法的效能評估
圖4A顯示模型能夠提供穩定的預測效能。在TP1時，neomer模型顯示出高風險患者的風險約為低風險患者的3.6倍（HR=3.62，95%Cl，1.49–8.81，p=0.0026）。在TP2時，該模型顯示出風險約為3.9倍（HR=3.91，95%Cl，1.54–9.92，p<0.0022；見圖4B）。TP3時該模型預測高風險患者的風險為4倍（HR=4.00，95%Cl，1.15–13.93，p<0.019；見圖4C）。此外，研究模型成功識別出在TP1治療後有復發風險的10名高風險患者，並在TP2預測了2名復發患者為高風險（見圖5）。總體而言，生存曲線顯示，模型在不同時間點都能夠保持區分高風險患者的能力（平均HR=3.84，標準差=0.19，見圖4）。
圖4 模型對於無進展生存期（PFS）的預測分析
圖5 放射學確認復發前的neomer模型預測和ctDNA檢測狀態
將模型預測的結果與ctDNA突變分析的結果進行比較後發現，基於ctDNA變化的方法在TP1時敏感性為40%（95%Cl，21.1%–61.3%），特異性為78.6%（95%Cl，49.2%–95%）；TP2時敏感性為45%（95%Cl，23.1%–68.5%），特異性為100%（95%Cl，75.3%–100%）；TP3時敏感性為18.2%（95%Cl，2.28%–51.8%），特異性為85.7%（95%Cl，57.2%–98.2%）。
此外，模型與基於ctDNA突變的方法之間存在顯著重疊，表明對高風險患者的預測具有相互一致性（如圖6所示）。TP3時，neomer模型識別出6名高風險患者，而突變分析檢測到4名ctDNA陽性患者，其中2名患者被兩種方法均預測為高風險，neomer模型的敏感性比突變分析高出2.5倍（見表1）。此外，neomer模型在三個時間點與基於ctDNA突變的方法顯示出良好的一致性，Cohens Kappa值分別為TP1：0.2800（95%Cl，0–0.5979），TP2：0.5416（95%Cl，0.2189–0.8645），TP3：0.2574（95%Cl，0–0.6941）。
圖6 提高檢測疾病進展高風險患者的敏感性
在不同時間點，ctDNA陽性患者的復發風險顯著波動：TP1時風險增加約2.1倍（HR=2.08，95%Cl，0.92–4.73，p=0.074），TP2時增加約9.5倍（HR=9.47，95%Cl，3.06–29.3，p<0.0001），TP3時增加約1.5倍（HR=1.49，95%Cl，0.32–7.00，p=0.61）。相比之下，neomer模型預測的高風險患者風險更為穩定。
ctDNA突變分析在所有患者及三個時間點的表現均不及neomer模型。在所有患者中，neomer模型預測了19例高復發風險患者，而突變分析檢出18例ctDNA陽性患者；在三個時間點的患者中，neomer模型預測6例高風險患者，突變分析檢出7例ctDNA陽性患者，兩者敏感性相似。在TP1和TP2時，neomer+突變因素是影響復發風險的最顯著因素（TP1: p=0.007；TP2: p=0.004），但在TP3時不顯著（p=0.117）。年齡在TP2時也是顯著影響因素之一（p=0.013）。
此外，結合neomer模型和ctDNA突變分析的方法在三個時間點均提高了敏感性，同時保持了相似的特異性。聯合模型在TP1、TP2和TP3的敏感性分別為60%、55%和54.5%，特異性分別為78.6%、92.3%和85.7%。聯合方法的整體準確性在三個時間點均高於單獨使用neomer模型或ctDNA突變方法，顯示出臨床應用上的潛力。
綜合三個時間點的資料，聯合模型的敏感性達到77.8%，特異性為70.6%，高風險患者的風險是低風險患者的4.51倍（HR=4.51，95%Cl，1.77–11.51，p=0.0007）。在三個時間點均有資料的19名患者中，聯合模型的敏感性更是高達88.9%，特異性為80%，高風險患者的風險是低風險患者的13.37倍（HR=13.37，95%Cl，1.63–109.4，p=0.0022）。自助法分析（n=1000）進一步證實了整合模型在預測患者復發風險方面的優勢和準確性。
研究意義與展望
總體而言，本研究基於無創液體活檢技術，透過監測NSCLC患者CRT後的ctDNA，成功評估了其作為預後標誌物的潛力。 利用血漿樣本中的neomer特徵，研究開發了一種超靈敏測定法，為無法手術的侷限性NSCLC患者提供了一種新的監測和復發風險評估手段。這種方法不僅無需預先獲取腫瘤樣本，而且透過結合neomer和機器學習模型，顯示出優於傳統突變檢測的預測能力。
同時，研究存在樣本量小和缺乏獨立驗證佇列等侷限性，期待未來透過增加樣本量和建立多中心合作，克服當前研究侷限，進一步增強預測模型的穩健性和適用性，旨在為NSCLC患者提供更全面和精準的預後資訊參考。
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參考文獻：
[1]Kafkova LR, Mierzwicka JM, Chakraborty P, et al. NSCLC: from tumorigenesis, immune checkpoint misuse to current and future targeted therapy[J]. Front Immunol. 2024 Feb 7:15:1342086.
[2]N. Howlader and A. M. Noone, SEER Cancer Statistics Review, 1975–2018, eds. M. Krapcho, D. Miller, and A. Brest et al. (Bethesda, MD: National Cancer Institute, 2021).
[3]R. S. Zheng, R. Chen, B. F. Han, et al. Cancer Incidence and Mortality in China, 2022, Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 46, no. 3 (2024): 221–231.
[4]C. Bettegowda, M. Sausen, R. J. Leary, et al. Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage Human Malignancies, Science Translational Medicine 6, no. 224 (2014): 224ra24.
[5]I. Georgakopoulos-Soares, O. Yizhar-Barnea, I. Mouratidis, et al. Absent From DNA and Protein: Genomic Characterization of Nullomers and Nullpeptides Across Functional Categories and Evolution, Genome Biology 22, no. 1 (2021): 245.
[6]Wu, Y., Li, C., Yang, Y., et al. (2024). Predicting Disease Progression in Inoperable Localized NSCLC Patients Using ctDNA Machine Learning Model. Cancer medicine, 13(20), e70316.
[7]Y. Yang, T. Zhang, J. Wang, et al. The Clinical Utility of Dynamic ctDNA Monitoring in Inoperable Localized NSCLC Patients, Molecular Cancer 21, no. 1 (2022): 117.
審批編號：CN-148445 有效期至：2025-03-01
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